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普通PCR简述

Brief introduction of ordinary PCR

1、生长简史

20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外疏散技术。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。可是,其时的基因序列剖析要领尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发明。1985年,美国科学家Kary Mullis发明了PCR技术,并在Science杂志上宣布了关于PCR技术的第一篇学术论文。今后,PCR技术获得了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的革新,提高了扩增的真实性。此后,Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高。

2、技术原理

DNA的半保存复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的加入下,凭据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在聚合酶链式反应实验中发明,DNA在高温时也可以爆发变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变革控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。( DNA高温变性低温复性)

发明耐热DNA聚条约酶#Taq酶关于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得很是简捷、同时也大大降低了本钱,PCR技术得以大宗应用,并逐步应用于临床。

3、普通PCR反应流程

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4、反应原理

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5、PCR循环

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6、与荧光定量PCR技术相比较主要缺点

1、通例PCR结合电泳剖析要领的缺点

2、只能对终产品进行剖析,无法对起始模版准确定量

3、必须在扩增反应结束后借助电泳要领剖析,费时费事

4、无法对扩增反应实时检测

5、EB有毒

荧光PCR简述

1、生长简史

界说:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变革,通过仪器软件实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产品量的变革,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量剖析。

2、荧光PCR检测分为两种要领:

荧光探针法和荧光染料法。

3、荧光探针法检测原理:

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4、荧光PCR如何实现实时监控的呢?

→ PCR反应体系中加入荧光染料

→ 所有的定量PCR仪器都有三个配合的组成部分(检测器、引发光源、热循环?椋

→ 在扩增历程中,荧光信号随着PCR产品的增加而增强

→ 每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统纪录荧光信号的增加

→ PCR软件盘算出数据,用于实验结果的剖析

→ 苏州鸿运国际产品技术平台:ARMS检测要领;1个SNP位点设计双管反应,含目的基因检测及内参检测双通道。

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5、技术特点:

→准确可靠,临床双盲比照试验>1000例,结果与金标准测序法比对,结果一致性大于99%。

→ 高灵敏:可检测低至10ng的人基因组DNA。

→快速:整个检测流程只需3小时。

→简便:试剂盒提供预混好的试剂,使体系配置操作简便。

→防污染

→高特异性:双重特异性组成,包管检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必须完全配对,才华延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产品配对,在延伸中爆发荧光。

6、临床基因检测技术比较:

要领

原理

适用

优点

弱点

操作

准确性

市场应用

DNA芯片

PCR-芯片杂交

多位点

多基因,多为点同时

少数位点

办法多,易污染

较高

临床使用

PCR-RFLP

PCR-酶切-电泳

SNP位点

多位点

办法多,易污染

较高

逐步淘汰

Sanger测序

PCR-测序

SNP位点,缺失突变

 

时间长

办法多

金标准

无注册证

PCR-荧光染料法

荧光PCR

单个基因

快速,简便

假阳性

简简单步

核酸检测

PCR-荧光探针法

Taqman

SNP,多态性

快速,简便

少数位点

简简单步

普及

液相芯片法

PCR-液相杂交

SNP, 多基因,多位点

 

易污染

办法多

较高

非主流

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